农残级乙酸乙酯：色谱法在药物研发中的一般应用
农残级乙酸乙酯彪仕奇带您了解色谱法在药物研发中的一般应用，薄层色谱（TLC）法主要用于药物的定性鉴别，可从斑点的位置（Rf值）与颜色两方面对药物进行定性，优于HPLC和GC法（只能从色谱峰保留时间把握药物的定性性质），定量时仅用于有关物质的限度检测（半定量），结合不同原理的检视技术，TLC法能见到分析的“全图”（whole picture）,使各有关物质斑点均可显示，但变异比HPLC法大；HPLC和GC法的主要优势为定量，但如果运用得当，尤其在含量测定或有关物质项下已采用本法的情况下，利用对照品与供试品保留时间相同的特性作为鉴别依据，既不必专门实验又增加了鉴别的专属性，是非常可取的。由于分离分析的定量优势，HPLC或GC法成为新药研发不可缺少的手段，尤其生物样品中药物的定量，HPLC或GC法为最常用的分析手段。
1、定性鉴别
色谱法对同系物或具有相同母核药物（尤其制剂）的鉴别具有光谱法和化学法无可比拟的优势。但方法专属性须经充分验证，确保结构相近化合物或最难分离物质对在拟定色谱条件下能良好分离。申报资料所用鉴别法的色谱条件多数与有关物质、含量测定一致，实际上，在后两者的方法学研究中，多以合成中间体、起始原料以及降解产物考察其专属性，但在鉴别中，则以能够与结构相似的同类药物良好分离为主要考虑，故在专属性验证中宜得到体现。
但在实际操作中有时遇到同一物质在完全相同的色谱系统中保留时间不一致的情况，药典中对保留时间（斑点位置）的一致性未予具体规定。对此，可采用如下措施：（1） 注意色谱系统的稳定性，流动相（展开剂）与固定相相匹配，在C18柱的反相色谱系统中，流动相有机溶剂比例不低于5％，避免C18链的随机卷曲将造成色谱系统不稳定导致组份保留值波动的现象；TLC的色谱展开要适中，使主斑点的Rf值在0.2～0.7间。（2） 操作中另配制一供试品与对照品等量混合的溶液，进样（点样）后出现单一色谱峰（斑点）作为鉴别依据，以弥补该法之不足。
2、有关物质检查
TLC法因设备和操作简便、检视（显斑）方法多而较常用，但由于其变异性大，应充分验证系统的适用性，使各斑点Rf值在0.2－0.7之间，并应分离清晰。新版欧洲药典提出了斑点分离度计算公式：Rs=1.18α(RF2-RF1)/ωh1+ωh2(Rs:分离度，α：溶剂前沿，RF2、RF1：比移值，ωh1、ωh2：斑点宽)，可积累经验予以采纳。杂质检测可用对照品比较法或自身对照法，前者用于已知杂质控制并需杂质对照品，也可两种方法结合应用，自身对照法应注意杂质斑点与主成分斑点色调应一致，具有可比性，必要时可选用荧光薄层板，利用荧光熄灭法检视，或两种检视方法结合应用。结果的判断，除控制杂质的斑点数与限度外，也可采用两种以上不同浓度的对照溶液分别比较。如某药品，用自身稀释成1.5%和0.5%两种浓度的对照液，供试液如显杂质斑点，不得多于3个，允许1个超过0.5%，但不得过1.5%，其余杂质斑点均不得过0.5%作限量要求。
在TLC法的方法学研究中，可配制多个展开剂系统及不同的吸附剂，进行几种组合的试验，将主成分与已知的中间体、副产物、降解物或异构体斑点的颜色及分离情况进行对比，确定最佳色谱系统。同时要采用适宜的稀溶液验证其灵敏度，确定合适的检视方法，处理好灵敏度与杂质限度的关系。并通过适当改变展开剂比例及pH值，考察检测方法的耐用性。由于影响TLC法重现性因素较多，如薄层板质量、点样技术、展开室温湿度等都可能影响色谱分离度或灵敏度，需在质量标准中对分离度和灵敏度做出明确要求，如：实验时，除供试液、对照液点样外，主药与另一结构相近化合物（最难分离物质对）混合溶液，以及另一低于标准限度的对照溶液同时点样，要求混合溶液应显示分离良好的斑点，后者应显示清晰斑点，以确保检测结果的可靠性。
根据药物的理化性质，HPLC法首选C18柱；流动相首选甲醇－水系统，必要时加入某种溶剂如乙腈或少量酸碱溶液、缓冲液等，以硅胶为载体的键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相，pH大于8时，可使载体硅胶溶解，此时应选用包覆聚合物填充剂、高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、非硅胶填充剂或有机－无机杂化填充剂等耐碱填充剂；pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落，此时应选用有机－无机杂化填充剂、具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或而异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶等耐酸填充剂；如分离不好可选用其它类型柱和流动相，对某些品种需用特定牌号的填充剂方能满足分离要求时，可注明适用的牌号；检测器首选UV检测器，流动相合适时，蒸发光散射检测器可能更好，可积极研究，成熟时予以采用。
采用的定量方法有：
（1）杂质对照品法，即外标法。仅限于对已知杂质的控制，如采用该法，则应注意对该对照品进行定性研究，并制订其质量要求。
（2）加校正因子的主成分自身对照法，即以主成分作对照的内标法，校正因子可在检测时测定，但需提供杂质对照品，也可在建立方法时将测得的校正因子载入质量标准，供以后常规检验使用，无需长期提供杂质对照品，但也仅适于已知杂质的控制。
（3）不加校正因子的主成分自身对照法，实质上也是以主成分作对照的内标法，但其前提是假定杂质与主成分的响应因子相同，适用于具有与主成分相同或类似发色团的杂质，因一般情况下，有关物质与主成分具有相似的分子结构，此法不致发生太大误差。
（4）峰面积归一法，简便快捷，但因各杂质响应因子不一定相同、杂质量与主成分量不一定在同一线性范围、仪器对微量杂质和常量主成分的积分精度及准确度不同等因素，可产生较大的误差。
一般情况下，校正因子在0.9～1.1时可不予校正，即3法，校正因子在0.5～5.0以外时，应改变检测波长使在该范围内，如无法调节，应采用（1）法；由于有关物质中有已知的亦有未知的杂质，故采用（1）＋（3）法或（2）＋（3）法比较理想，同时控制产品中的已知杂质和未知杂质；使用（3）法时，应在考察已知有关物质的校正因子（应位于0.5～5.0以内）或结合二极管阵列检测结果（主成分与各有关物质的UV吸收偏差应不大）后采用，也可根据物料平衡原理（含量测定值与有关物质值的和与供试品理论总量的偏差）验证方法是否可行；一般不主张在质量标准中采用（4）法，但在对映体杂质的检测中是一个简捷的方法，也可用于稳定性研究中对杂质变化的监测。
3、含量测定：色谱法按外标法或内标法以峰高或峰面积进行定量。
内标法用于GC和HPLC减小测定误差，曾经起到很好的作用，特别是在GC中，进样量小，内标法能显著提高定量精度，随着现代分析仪器的发展，原手动进样已被定量环或自动化程度高的进样器所取代，内标法的应用受到挑战，尤其在HPLC中，由于进样量大，外标法已具有很好的进样精度，加入内标，有时反而对分析不利，有研究者曾随机选取药典中八个内标法测定含量的药品进行试验，结果表明，内标法均不能提高分析精度，实际上，内标法使分析误差与经常校准的外标法相比增加了√2倍，说明测定两个峰比测定一个峰引入的误差要大。一般情况下，如下情况适合于使用内标法：复杂的样品制备过程，如多次提取；低浓度的样品（灵敏度是确定的），如药代动力学的研究；在样品分析中预计是很宽的浓度范围，如药代动力学研究。外标法多用于原料验收、成品质控、稳定性和TLC法，内标法多生物体液和GC法。需要注意的是，在外标法中，保持供试品浓度与对照品浓度相近可以改善方法的准确性。
峰高定量仅在峰高随样品量呈线性变化时使用，当峰形不正或色谱柱超载时，峰高法会出现较大误差，由于峰高测量受相邻重叠峰的干扰较小，故比峰面积定量更为准确，如BP中庆大霉素C组份检测明确要求峰高定量。峰面积定量的好处是其精度受仪器参数变化的影响较小，对不是高斯分布的峰形也能较好定量，但其准确度受相邻峰重叠的影响。一般情况下，为得到较好的精确度，宜用峰面积定量；为最大限度地排除其它组份的干扰，则多用峰高定量。痕量分析中多用峰高法定量。
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